本文是学习GB-T 33839-2017 基于生物效应含碳基纳米材料生物样品的透射电子显微镜检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了用透射电子显微镜(以下简称透射电镜)检测含有碳基纳米材料的生物样品超微结构
的技术和规范。
本标准适用于含碳基纳米材料的生物薄试样透射电镜分析检测。
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GB/T 18873—2008 生物薄试样的透射电子显微镜-X 射线能谱定量分析通则
GB/T 19619—2004 纳米材料术语
GB/T 19619—2004 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
碳基纳米材料 carbon-based nanomaterials
分散相尺度至少有一维小于100 nm 的碳材料。
注：分散相由碳原子组成。碳基纳米材料主要包括三种类型，即一维碳基纳米材料(包括碳纳米管和碳纳米纤维
等),二维碳基纳米材料(包括石墨烯和纳米石墨片等)以及零维碳基纳米材料(包括碳纳米颗粒和富勒烯球
等 ) 。
3.2
生物效应 biological effect
纳米材料与生命过程的相互作用导致生物体形态结构及功能的变化。
3.3
生物薄试样 biological thin specimen
采用超薄切片机切片、厚度为40 nm～100nm 的生物试样，用于透射电镜观察。
碳基纳米材料的表面理化特性使其易形成团聚，经分散后与生物体接触。碳基纳米材料与生物体
接触后，需采用超微结构制样方法，制成生物薄试样。在透射电镜下检测碳基纳米材料作用于生物体后
产生的细胞及细胞器的超微结构变化，以确定碳基纳米材料对生物体的生物效应。用高能电子束照射
生物薄试样的微小区域，入射的电子束大部分透过薄试样，透射电子携带有生物薄试样内部信息，成像
形成生物薄试样的超微结构图像。
GB/T 33839—2017
超薄切片机、透射电镜的工作环境应符合以下要求：
a) 超薄切片机：相对湿度小于60%,温度(20±5)℃,电源电压(220±22)V。
b) 透射电镜：相对湿度小于60%,温度(20±5)℃,电源电压稳定(220±22)V,
具备仪器专用地 线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。
6.1.1 将碳基纳米材料与溶剂按一定的比例充分混和。
6.1.3 将不同浓度、已分散的碳基纳米材料悬液约10μL 滴在有支持膜(Fomvar
膜或碳膜)的透射电 镜专用载网上，干燥后待检。
6.2.1
取材：将含碳基纳米材料的生物组织在2%或3%戊二醛固定液(4℃)中迅速切成小于1
mm³ 的小块。配制戊二醛固定液可参考附录 A。
6.2.2 前固定：将小块组织浸泡在20倍体积、4℃的2%或3%戊二醛固定液中固定1
h～4 h,用 0.1 mol/L磷酸缓冲液充分漂洗。
6.2.3 后固定：将生物小块组织浸泡在1%四氧化锇固定液，4℃固定2 h。
配置四氧化锇固定液可参 考附录 B。
6.2.4
脱水：用乙醇或丙酮梯度脱水。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%乙醇
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各一次；90%丙酮1次，100%丙酮3次；每次10 min～15 min。
6.2.5 包埋：在按比例配制好的Epon812
环氧树脂包埋剂中浸透后，在胶囊(或硅胶包埋板)内进行包
埋。建议浸透比例为，丙酮：包埋剂(浸透时间):1:1(1 h～2h);1:2(12h);
纯包埋剂(1 h)。 Epon812 环氧树脂包埋剂配制比例可参考附录 C。
6.2.6 聚合：在恒温烘箱内进行聚合，37℃聚合12 h 后，升温至60℃聚合36
h～48 h。
6.2.7
修块：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状。
6.2.8
超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，并将切片捞至载网晾干，切片厚度
一般要求在40 nm～100 nm。
6.2.9 染色：采用醋酸双氧铀和枸橼酸铅对超薄切片进行重金属盐染色后待检。
6.3.1
前固定：用细胞刮将细胞从培养皿底部刮下或胰酶消化下来，低速离心(2500
r/min,5 min) 成
小团块于离心管底部，弃上清液，加入3%戊二醛，吹散细胞团块，4℃冰箱固定1
h～4 h。
6.3.2 凝块：用1 mol/L
磷酸缓冲液漂洗3次后，加入小牛血清，使细胞悬浮于血清中后，离心 (4000
r/min,5
min)成小团块，弃上清液，沿管壁加入2%或3%戊二醛固定液，放入4℃冰箱固定过
夜。将细胞团块切成小于1 mm³ 的小块，用1 mol/L 磷酸缓冲液轻轻充分漂洗。
6.3.3 后固定：将细胞小块浸泡于1%四氧化锇，放入4℃冰箱固定1.5 h～2 h。
6.3.9 重金属盐染色(同6.2.9)后待检。
7.1.1.1
开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30 min 以上。
7.1.1.2
选择加速电压，检测生物薄试样所需的加速电压选择在60 kV～120 kV 之间。
7.1.1.3
调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。
7.1.1.4
对电子光学系统进行对中调整，消除像散，使透射电镜处于最佳工作状态。
7.2.1.1 将干燥的碳基纳米材料试样放入透射电镜。
7.2.1.2
在低倍(3000倍～4000倍)下寻找合适的试样部位，要求被分析试样无破损、无污染。
7.2.1.3
在高倍(40000倍～50000倍)时观察碳基纳米材料的分散情况和形貌，测量其尺寸并记录实
验结果。
7.2.2.1
在低倍(小于4000倍)下寻找合适的生物薄试样部位，要求被分析试样无破损、无污染、无振
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颤条纹。
7.2.2.2
将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心。
7.2.2.3
逐步增加放大倍数(一般放大倍数在10000倍～50000倍即可),寻找细胞内外、细胞器内外
有无碳基纳米材料。
7.2.2.4
仔细分析纳米材料分布的位置，注意区分样品制备过程中引入的污染物和碳基纳米材料。无
法判别时，建议按GB/T18873—2008 规定的X
射线能谱分析方法对颗粒物进行定性分析。
7.2.2.5 精确聚焦图像并存储实验结果。
分析结果报告应包括以下信息：
a) 分析报告的唯一编号；
b) 送样人姓名、单位和地址；
c) 样品的接收日期；
d) 分析仪器及其工作条件；
e) 分析结果和必要的说明；
f) 分析报告负责人的签字；
g) 分析报告的页码；
h) 实验室名称和地址；
i) 分析报告的日期。
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(资料性附录)
戊二醛固定液配制
A.1 配制2.0%戊二醛固定液(磷酸缓冲液，pH7.3):
量取0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.3)50mL, 加入纯化的25%戊二醛水溶液8 mL,
最后用双蒸水
定容至100 mL。 充分混匀。
A.2 配制3.0%戊二醛固定液(磷酸缓冲液，pH7.3):
量取0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.3)50 mL,加入纯化的25%戊二醛水溶液12 mL,
最后用双蒸水
定容至100 mL。 充分混匀。
注：戊二醛固定液宜现配现用。
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(资料性附录)
四氧化锇固定液配制
B.1 配制2%四氧化锇贮存液：
将装有四氧化锇的安瓿(共2
g)洗净，用玻璃划割器刻痕，再用双蒸水冲洗几次，放入洁净棕色广口
玻璃瓶内，加上100 mL
双蒸水，用洁净玻璃棒捣破安瓿。然后用封口膜将广口玻璃封口，贴上标签，置
于干燥器中，4℃保存备用。
B.2 配制1%四氧化锇固定液(磷酸缓冲液，pH7.3):
等量0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.3) 与2%四氧化锇贮存液混合，现配现用。
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(资料性附录)
环氧树脂 Epon812 包埋剂配制
环氧树脂 Epon812 包埋剂配制比例见表C.1。
表 C.1 环氧树脂 Epon812 包埋剂配制比例
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| 2 g | 3 g | 5 g | 0.16 mL | 10 mL |
| 4 g | 6 g | 10 g | 0.32 mL | 20 mL |
| 6 g | 9 g | 15 g | 0.48 mL | 30 mL |
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